Microscopía Óptica y Confocal

NORMAS CON CARÁCTER GENERAL

1. El contenido de estas Normas afecta a todos los usuarios de los equipos de microscopía del IBIS.
2. Es responsabilidad de cada usuario cumplir adecuadamente las normas. Es responsabilidad del técnico de Microscopía detectar malas prácticas respecto al uso de los equipos y ponerlas en conocimiento de los usuarios que las han provocado y de sus investigadores responsables. Es responsabilidad de cada IR el hacer cumplir las normas a todos los miembros de su grupo.
3. Pueden solicitar el uso de los equipos los grupos de investigación del IBIS. Previo permiso de la Dirección del IBIS pueden solicitarlo grupos de distintos servicios del Hospital Universitario Virgen del Rocío, de la Universidad de Sevilla, así como de otras Universidades y Centros de Investigación Públicos y empresas privadas.
4. Cada nuevo usuario del Servicio de Microscopía tiene que haber leído las Normas y aceptarlas, mandando un documento firmado de aceptación.
5. Cualquier servicio que pudiera implicar modificaciones en la dinámica de microscopía precisará de la autorización de la Dirección.
6. Los usuarios pertenecientes a los grupos de Investigación del IBIS tienen prioridad sobre otros en la utilización de los servicios ofertados.
7. En caso de alta ocupación de los equipos se dará prioridad de uso al personal investigador del IBiS, limitándose las reservas por parte de estudiantes de TFG y TFM sin supervisión.
8. Las reservas de los equipos se realizarán en la plataforma habilitada para ello https://servicios.ibis-sevilla.es/. Las incidencias que pudieran ocurrir en la reserva de los equipos se comunicarán al responsable del Servicio y al responsable de Informática (fcazorla-ibis@us.es).
9. Queda prohibido el uso de los equipos sin la realización de las reservas previas correspondientes. En este caso, el usuario será debidamente percibido. Si se detectara el uso de equipos sin la reserva hecha después del primer aviso se penalizaría con el precio duplicado del uso del equipo.
10. Las reservas serán de 4 horas máximo por persona y día. Un usuario podrá reservar un máximo de 12 horas por semana en un equipo. En caso de que no haya otra reserva, se podrá contemplar la posibilidad de ampliar la reserva del usuario. La limitación de uso puede cambiarse con el previo aviso acorde a las circunstancias de trabajo en el Centro.
11. Las reservas se harán por tramos de cuartos de hora, así como la tarificación se hará por cada cuarto de hora. Dichas reservas se podrán realizar con un máximo de dos semanas de antelación, salvo casos debidamente justificados.
12. La cancelación o modificación de la reserva debe realizarse antes de comienzo de la hora de la reserva.
13. La cancelación de reservas se deberá comunicar a la mayor brevedad posible, en cualquier caso, antes del comienzo de la sesión reservada. Se esperará 15 minutos de cortesía antes de permitir a otro usuario el uso del microscopio.
14. En la reserva debe figurar el nombre de la persona que va a usar el equipo, no la que hace la reserva.
15. El comienzo de la utilización de los equipos más tarde de lo reservado no exime del pago de su uso. Los usuarios tienen derecho a modificar sus reservas 10 minutos antes del comienzo de su sesión, siendo ellos responsables de buenas prácticas de reservas y planificación de su tiempo y respeto a otros usuarios.
16. Si un usuario ha terminado su trabajo antes de su hora de finalización de reserva la puede modificar en la plataforma o pedir al personal del Servicio que lo haga. No se puede modificar la hora del comienzo una vez la sesión haya empezado.
17. En las reservas deben figurar el nombre de usuario, el laboratorio al que pertenecen, el tipo de uso para los microscopios convencionales: campo claro (BF de brightfield), fluorescencia (fluo) o licencia de software (PC) y los láseres que se van a usar en caso de los confocales (Leica SP2-AOBS y Nikon A1R+). Cuando en la reserva no se especifica el tipo de uso se facturará al precio más caro para el equipo.
18. Queda prohibido el uso de los microscopios y de ordenadores con los guantes para evitar la contaminación de los equipos.
19. Los usuarios serán asesorados y ayudados por el personal técnico del Servicio.
20. Los ordenadores deben apagarse a la finalización del trabajo.
21. La grabación de datos se realizará vía intranet al servidor. Estos datos se recuperan mediante una conexión al servidor. Esta conexión, si fuera precisa, se solicitará al Responsable de Informática por correo electrónico: fcazorla-ibis@us.es.
22. Los técnicos del Servicio no se hacen responsables de la pérdida imprevista o daño de los archivos correspondientes a las carpetas de datos de los ordenadores. Por ello es recomendable que todo usuario grabe sus datos en el servidor y los descargue en su sitio de trabajo al finalizar cada sesión de trabajo. Una vez comprobado que sus datos se hayan transferido correctamente los usuarios tienen que eliminarlos tanto de los ordenadores de captura como del servidor. El servidor solo sirve para el traspaso de datos, y no para el almacenamiento.
23. Es obligatorio limpiar el equipo con un pañuelo de papel en caso de que se derrame sobre éste medio de cultivo o cualquier otra sustancia.
24. Al finalizar el experimento es necesario poner las fundas a los microscopios para evitar que se ensucien o se dañen.
25. Hay que dejar limpio el sitio de trabajo, sin guantes, papeles ni otros materiales, para evitar que el próximo usuario tenga que dedicar su tiempo para recoger lo que el anterior haya dejado.
26. Las muestras olvidadas en las salas de los microscopios que no tengan identificado el laboratorio de procedencia serán desechadas a la semana.
27. No está permitido el uso de los equipos sin tener los conocimientos suficientes para su manejo.
28. Si no se tiene el conocimiento necesario sobre el funcionamiento de un equipo, se debe contactar con alguno de los técnicos y solicitar un entrenamiento básico previo a la utilización de los mismos.
29. Queda totalmente prohibido el uso de los microscopios si se tiene alguna infección ocular.
30. Queda prohibido llevar cualquier tipo de bebida o comida a las salas de microscopios.
31. Queda totalmente prohibido usar los equipos para un fin que no sea exclusivamente el suyo.
32. Los usuarios que no cumplan las normas generales serán amonestados, pudiendo llegarse a no permitirles el uso durante un tiempo. En el supuesto de que persistiera el incumplimiento, se comunicará al IR del grupo y en su caso a la Dirección del centro.

NORMAS ESPECIFICAS

El Servicio de Microscopia cuenta con equipos capaces de trabajar con diversas modalidades de iluminación, detección y adquisición que permiten trabajar con diferentes aplicaciones y muestras.

Microscopia de campo claro con luz transmitida

Microscopía de fluorescencia convencional

Microscopía de campo claro y de fluorescencia avanzada

Microscopía confocal de barrido por láser de fluorescencia y reflexión

Microdisección de muestras en campo claro o con fluorescencia.

Microscopia de campo claro con luz transmitida

·      Microscopía de campo claro.

·      Microscopía de campo claro con contraste de fases.

·      Microscopía de campo claro con contraste interferencial de Nomarski (DIC).

La microscopia de campo claro está basada en la transiluminación de muestras desde una fuente de luz blanca, enfocado por un condensador para traspasar la muestra hasta llegar a la lente del objetivo que recoge la luz para su visualización en los oculares o adquisición con una camera digital. Es una técnica útil para visualizar células, tejidos, cortes histológicos con marcaje colorimétrico, animales modelos (pez cebra, C. elegans). Contraste de fases y de Nomarkski son modalidades de visualización de campo claro usando lentes y elementos ópticos específicos para mejorar el contraste de estructuras que de otras formas serían invisibles. 

Microscopía de fluorescencia convencional

·      Microscopios directos con lamparás de mercurio (o similar)

·      Microscopios invertidos con lamparás de mercurio (o similar)

Fluorescencia es un proceso de absorción de un fotón y posterior emisión de otro fotón de menor energía (longitud de onda más larga) por una molécula (fluoróforo). La epifluorescencia convencional combina una fuente de luz blanca potente con filtros y espejos ópticos para separar distintos haces de luz y para tener especificas longitudes de onda de excitación y detección para cada fluoróforo. Usando técnicas de marcaje podemos combinar diferentes fluoróforos para marcar estructuras celulares (tipos celulares) y subcelulares (membrana plasmática, núcleo, etc.).

El IBiS cuenta con varios microscopios de epifluorescencia convencional que son aptos para la visualización de cortes histológicos fluorescentes, células de cultivo fijadas, modelos animales. La mayoría de los microscopios fluorescentes pueden trabajar con marcadores que emiten en azul (DAPI, Hoescht), Verde (GFP, FITC, Alexafluor 488) y Rojo (TRITC, Alexafluor 555). Para otros marcadores diríjase al Equipamiento y/o instalaciones para saber las especificaciones exactas o consulta al técnico responsable.

Microscopía de campo claro y de fluorescencia avanzada

·      Microscopio Thunder de alta velocidad y 8 canales de LED

·      Microscopios NewCast para estereología

Además de microscopios convencionales el IBiS cuenta con los microscopios de campo claro y de fluorescencia avanzados que combinan mejoras de hardware y software para poder adquirir imágenes de mejor calidad, con mayor velocidad y con más información a nivel cuantitativo.

El microscopio Thunder combina el hardware optimizado para la adquisición a muy altas velocidades en todos los ejes con un software de procesamiento automático de imágenes. El resultado es un sistema que puede trabajar como un efectivo escáner de portas con cortes histológicos o cultivos de células, compatible con contraste de fases en campo claro, marcajes colorimétricos y hasta 8 canales de fluorescencia.

Los microscopios Newcast combinan la adquisición automática de imágenes mosaicas de áreas grandes de muestras histológicos, de campo claro o fluorescencia, con herramientas especiales de estereología que permiten la obtención de datos no sesgados (ej. área, volumen) de forma estadísticamente robusta estudiando solo una pequeña parte de muestras extrapolando los datos al tejido completo.

Microscopía confocal de barrido por láser de fluorescencia y reflexión.

·      Microscopio Confocal Leica SP2

·      Microscopio Confocal Nikon A1

·      Microscopio Confocal Leica Stellaris 8

El microscopio confocal es un microscopio que emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y poder realizar finos cortes ópticos con la posibilidad de reconstrucción de imágenes tridimensionales. Estos equipos se utilizan principalmente tanto para las muestras marcadas con fluorescencia, como existe la posibilidad de utilizar la luz refractada: dientes, huesos, también son buenos candidatos para su uso con la técnica del microscopio confocal.

Microdisección de muestras en campo claro o con fluorescencia.

La microdisección láser permite el aislamiento de fracciones de tejido o células individuales en preparaciones microscópicas para su análisis mediante técnicas de biología molecular. Los especímenes se montan sobre una membrana que se protege mediante un portaobjetos de cristal de manera, que se evita la contaminación de la muestra por impurezas del medioambiente lo que es crucial para cualquier aplicación que implique extracción de RNA. Una vez seleccionadas, las células se cortan bajo la gestión por software utilizando una luz del láser sólido de alta precisión. Microdisección de células únicas o recortes de regiones de tejido de interés es aplicable a muchos campos de investigación tales como: Patología Molecular, Biología Celular, Investigación del cáncer, Medicina forense, Neurociencia, Investigación alimentaria.

Microscopia de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y Superresolución (STORM)

La microscopia de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF, del inglés: Total Internal Reflection Microscopy) aprovecha un fenómeno físico que permite inclinar el haz de láser para que se refleje por completo dentro del cubreobjeto/base de placa y únicamente ilumine una parte de muestra muy cercana (~200 nm) al cubreobjeto. Es una técnica muy útil para estudios de membrana plasmática, dinámica de receptores, integrinas y citoesqueleto, que permite el seguimiento de moléculas individuales, dando mucho contraste, alta resolución axial con muy poca fototoxicidad y fotobleaching. Esta técnica se puede combinar con Superresolución (STORM) donde se aprovecha la activación de fluorocromos específicos individuales para conseguir una resolución lateral de hasta 20 nm.

Aplicaciones destacadas y servicios

·      Colocalización de marcajes de fluorescencia y análisis de superficies mediante microscopía confocal.

·      Experimentos tipo FRET (Förster resonance energy transfer) y FRAP (fluorescence recovery after photobleaching).

·      Fluorescencia de tiempos de vida (FLIM) que permite distinguir fluorocromos por sus tiempos de vida característicos y realizar estudios moleculares tipo FLIM-FRET. 

·      Reconstrucción en 3D y cuantificación.

·      Experimentos in vivo con muestras biológicas, con incubación y control de temperatura, humedad, CO₂ y O₂.

·      Participación en la elaboración de protocolos para el procesamiento de muestras para microscopía (técnicas de fijación, tinción, marcaje, etc.)

·      Asesoramiento para la planificación de proyectos que pudieran requerir el uso de la Microscopía Confocal.