Microscopía Óptica y Confocal

El Servicio de Microscopia cuenta con equipos capaces de trabajar con diversas modalidades de iluminación, detección y adquisición que permiten trabajar con diferentes aplicaciones y muestras.

• Microscopia de campo claro con luz transmitida
• Microscopía de fluorescencia convencional
• Microscopía de campo claro y de fluorescencia avanzada
• Microscopía confocal de barrido por láser de fluorescencia y reflexión
• Microdisección de muestras en campo claro o con fluorescencia
• Microscopia de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y Superresolución (STORM)

• Microscopia de campo claro con luz transmitida

• Microscopía de campo claro.
• Microscopía de campo claro con contraste de fases.
• Microscopía de campo claro con contraste interferencial de Nomarski (DIC).

La microscopia de campo claro está basada en la transiluminación de muestras desde una fuente de luz blanca, enfocado por un condensador para traspasar la muestra hasta llegar a la lente del objetivo que recoge la luz para su visualización en los oculares o adquisición con una camera digital. Es una técnica útil para visualizar células, tejidos, cortes histológicos con marcaje colorimétrico, animales modelos (pez cebra, C. elegans). Contraste de fases y de Nomarkski son modalidades de visualización de campo claro usando lentes y elementos ópticos específicos para mejorar el contraste de estructuras que de otras formas serían invisibles.

• Microscopía de fluorescencia convencional

• Microscopios directos con lamparás de mercurio (o similar)
• Microscopios invertidos con lamparás de mercurio (o similar)

Fluorescencia es un proceso de absorción de un fotón y posterior emisión de otro fotón de menor energía (longitud de onda más larga) por una molécula (fluoróforo). La epifluorescencia convencional combina una fuente de luz blanca potente con filtros y espejos ópticos para separar distintos haces de luz y para tener especificas longitudes de onda de excitación y detección para cada fluoróforo. Usando técnicas de marcaje podemos combinar diferentes fluoróforos para marcar estructuras celulares (tipos celulares) y subcelulares (membrana plasmática, núcleo, etc.).

El IBiS cuenta con varios microscopios de epifluorescencia convencional que son aptos para la visualización de cortes histológicos fluorescentes, células de cultivo fijadas, modelos animales. La mayoría de los microscopios fluorescentes pueden trabajar con marcadores que emiten en azul (DAPI, Hoescht), Verde (GFP, FITC, Alexafluor 488) y Rojo (TRITC, Alexafluor 555). Para otros marcadores diríjase al Equipamiento y/o instalaciones para saber las especificaciones exactas o consulte al técnico responsable.

• Microscopía de campo claro y de fluorescencia avanzada

• Microscopio Thunder de alta velocidad y 8 canales de LED
• Microscopios NewCast para estereología

Además de microscopios convencionales el IBiS cuenta con los microscopios de campo claro y de fluorescencia avanzados que combinan mejoras de hardware y software para poder adquirir imágenes de mejor calidad, con mayor velocidad y con más información a nivel cuantitativo.

El microscopio Thunder combina el hardware optimizado para la adquisición a muy altas velocidades en todos los ejes con un software de procesamiento automático de imágenes. El resultado es un sistema que puede trabajar como un efectivo escáner de portas con cortes histológicos o cultivos de células, compatible con contraste de fases en campo claro, marcajes colorimétricos y hasta 8 canales de fluorescencia.

Los microscopios Newcast combinan la adquisición automática de imágenes mosaicas de áreas grandes de muestras histológicos, de campo claro o fluorescencia, con herramientas especiales de estereología que permiten la obtención de datos no sesgados (ej. área, volumen) de forma estadísticamente robusta estudiando solo una pequeña parte de muestras extrapolando los datos al tejido completo.

• Microscopía confocal de barrido por láser de fluorescencia y reflexión

• Microscopio Confocal Leica SP2
• Microscopio Confocal Nikon A1
• Microscopio Confocal Leica Stellaris 8

El microscopio confocal es un microscopio que emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y poder realizar finos cortes ópticos con la posibilidad de reconstrucción de imágenes tridimensionales. Estos equipos se utilizan principalmente tanto para las muestras marcadas con fluorescencia, como existe la posibilidad de utilizar la luz refractada: dientes, huesos, también son buenos candidatos para su uso con la técnica del microscopio confocal.

• Microdisección de muestras en campo claro o con fluorescencia

La microdisección láser permite el aislamiento de fracciones de tejido o células individuales en preparaciones microscópicas para su análisis mediante técnicas de biología molecular. Los especímenes se montan sobre una membrana que se protege mediante un portaobjetos de cristal de manera, que se evita la contaminación de la muestra por impurezas del medioambiente lo que es crucial para cualquier aplicación que implique extracción de RNA. Una vez seleccionadas, las células se cortan bajo la gestión por software utilizando una luz del láser sólido de alta precisión. Microdisección de células únicas o recortes de regiones de tejido de interés es aplicable a muchos campos de investigación tales como: Patología Molecular, Biología Celular, Investigación del cáncer, Medicina forense, Neurociencia, Investigación alimentaria.

• Microscopia de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y Superresolución (STORM)

La microscopia de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF, del inglés: Total Internal Reflection Microscopy) aprovecha un fenómeno físico que permite inclinar el haz de láser para que se refleje por completo dentro del cubreobjeto/base de placa y únicamente ilumine una parte de muestra muy cercana (~200 nm) al cubreobjeto. Es una técnica muy útil para estudios de membrana plasmática, dinámica de receptores, integrinas y citoesqueleto, que permite el seguimiento de moléculas individuales, dando mucho contraste, alta resolución axial con muy poca fototoxicidad y fotobleaching. Esta técnica se puede combinar con Superresolución (STORM) donde se aprovecha la activación de fluorocromos específicos individuales para conseguir una resolución lateral de hasta 20 nm.

Aplicaciones destacadas y servicios

• Colocalización de marcajes de fluorescencia y análisis de superficies mediante microscopía confocal.
• Experimentos tipo FRET (Förster resonance energy transfer) y FRAP (fluorescence recovery after photobleaching).
• Fluorescencia de tiempos de vida (FLIM) que permite distinguir fluorocromos por sus tiempos de vida característicos y realizar estudios moleculares tipo FLIM-FRET.
• Reconstrucción en 3D y cuantificación.
• Experimentos in vivo con muestras biológicas, con incubación y control de temperatura, humedad, CO2 y O2.
• Participación en la elaboración de protocolos para el procesamiento de muestras para microscopía (técnicas de fijación, tinción, marcaje, etc.)
• Asesoramiento para la planificación de proyectos que pudieran requerir el uso de la Microscopía Confocal.